封闭是继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程；抗原或抗体包被时所用的浓度较低，吸收后固相载体表面尚有未被占据的空隙，封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而排斥在ELISA其后的步骤中干扰物质的再吸附；封闭的手续与包被相类似；最常用的封闭剂是0.05%~0.5%的牛血清白蛋白，也有用10%的小牛血清或1%明胶作为封闭剂的。