限制性核酸内切酶能够识别DNA的特异性序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶，切割的是DNA或RNA分子内部切断磷酸二酯键。重组DNA技术中常见的限制性核酸内切酶为Ⅱ类酶，大部分Ⅱ类酶识别DNA位点的核苷酸序列呈二元旋转对称，这种结构称为回文结构。有一些酶切割DNA后产生平头或钝性末端；有些核酸内切酶没有序列特异性的要求。核酸外切能力主要是通过限制核酸外切酶实现。