抗代谢类抗肿瘤药物的作用机制是通过干扰细胞正常代谢过程，抑制肿瘤细胞的生长和增殖。它们的化学结构与体内正常代谢物相似，能够掺入到代谢过程中，从而“以假乱真”，阻碍正常代谢途径。氟尿嘧啶的结构与嘧啶类代谢物相似，在体内可抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶，阻断脱氧尿嘧啶核苷酸转变为脱氧胸腺嘧啶核苷酸，进而影响DNA的合成，属于典型的抗代谢类抗肿瘤药。
环磷酰胺属于烷化剂类抗肿瘤药，它能与细胞中的亲核基团发生烷化反应，使DNA等生物大分子结构和功能受损，从而发挥抗肿瘤作用；硫酸长春新碱是植物来源的生物碱类抗肿瘤药，主要通过抑制微管蛋白聚合，影响纺锤体的形成，阻止细胞有丝分裂；丝裂霉素属于抗生素类抗肿瘤药，可与DNA发生交联，破坏DNA结构，抑制肿瘤细胞复制；顺铂是金属配合物类抗肿瘤药，能与DNA结合形成交叉联结，干扰DNA复制等过程，所以这些都不属于抗代谢类抗肿瘤药。