在三羧酸循环中，底物水平磷酸化是指在酶的作用下，将底物分子上的高能磷酸键直接转移给 ADP 生成 ATP 的过程。具体发生在琥珀酰 - CoA 合成酶催化琥珀酰 - CoA 转化为琥珀酸的反应中，这是三羧酸循环中唯一的一次底物水平磷酸化反应，该反应如下：琥珀酰—CoA+GDP+Pi↔琥珀酸+GTP+CoA-SH。生成的 GTP 可在核苷二磷酸激酶的作用下将高能磷酸键转移给 ADP 生成 ATP，因此相当于生成了 1 分子 ATP。